近日，我室颜晓梅教授课题组在细胞外囊泡携载小分子代谢物的单颗粒水平绝对定量及肿瘤化疗耐药机制研究方面取得重要进展。相关成果以“Absolute Quantification of Intravesicular Adenosine Triphosphate in Single Extracellular Vesicles Reveals Mitochondrial Bioenergetic Rewiring in Chemoresistance”为题发表于ACS Nano（DOI:10.1021/acsnano.6c15798）。

细胞外囊泡（EVs）是介导细胞间通讯的纳米级载体，其携带的蛋白质、核酸、脂质及小分子代谢物等不同类别的“货物”，可反映母细胞的生理与病理状态。其中，小分子代谢物直接记录母细胞的生物能量与代谢状态。然而，EV具有高度异质性，传统的群体平均分析难以区分关键功能亚群，如何在单颗粒水平对EV内特定小分子代谢物进行绝对定量，并同时获取粒径和表面蛋白等多参数信息，一直是领域内的分析难题。

针对这一瓶颈，研究团队以ATP为模式分析物，利用自主搭建的双激光纳米流式细胞装置，结合ATP特异性膜通透荧光探针，建立了单EV内ATP定量方法SPAQ-nFCM。该方法通过微流控芯片制备ATP负载脂质体标准品，建立了粒径-体积校正与荧光密度定量的通用校准框架，首次实现了单个EV内ATP浓度的绝对定量。进一步结合抗体标记，可同步解析EV粒径、ATP含量及CD63、P-gp（ABCB1）等表面蛋白信息。

图 | SPAQ-nFCM平台示意图

依托该平台，研究团队发现耐药癌细胞分泌的EVs中ATP显著富集。结合靶向代谢组学和Seahorse实时ATP产生速率分析表明，耐药癌细胞发生了以线粒体氧化磷酸化增强为主要特征的代谢重编程，使细胞内ATP水平升高，并进一步促进EV内ATP富集。抑制线粒体氧化磷酸化可显著降低ATP⁺ EV比例及囊泡内ATP含量，同时增强耐药癌细胞内阿霉素的积累。单颗粒多参数分析进一步发现，CD63⁺ EVs是ATP的主要载体之一，并解析出一个ATP富集的P-gp⁺ EV亚群，为线粒体能量代谢与药物外排泵在囊泡水平的空间耦联提供了直接证据。结合靶向siRNA筛选，研究团队还鉴定了Rab27a、Rab27b、VPS35和DRP1等参与ATP⁺ EV生物发生和货物分选的关键调控因子。该研究建立了单个EV内代谢物的定量分析框架，成功推动EV代谢物研究从定性表征向单颗粒定量分析拓展，为从囊泡水平解析细胞代谢重编程如何塑造囊泡通讯及揭示肿瘤化疗耐药机制提供了全新的技术手段。

该论文第一作者为化学化工学院2021级博士生肖栩，颜晓梅教授与厦门大学医学院苏国强教授为共同通讯作者。该研究得到国家重点研发计划（2024YFA1108700、2021YFA0909400）和国家自然科学基金（32450337、21934004）的支持。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acsnano.6c15798